CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA (App. II, 1, p. 734; III, 1, p. 455)

La c. è una tecnica di separazione che permette di frazionare una miscela nei suoi componenti sfruttando gli equilibri che si stabiliscono durante l'eluizione di una fase mobile attraverso una fase stazionaria. La fase mobile può essere liquida o gassosa; la fase fissa solida o liquida. Le numerose possibilità che offrono le tecniche cromatografiche sono dimostrate dalla sua applicazione estensiva alle analisi industriali (secondo alcuni autori l'80% di tutti i lavori sono effettuati usando tecniche cromatografiche).

A seconda del principio chimico-fisico che è alla base del processo i sistemi cromatografici vengono così suddivisi: a) c. d'adsorbimento; b) c. di ripartizione; c) c. a scambio ionico; d) gel-filtrazione.

Cromatografia d'adsorbimento (solido-liquido o solido-gas). - I legami si stabiliscono fra gli atomi superficiali della fase fissa (solida) e le molecole contenute nella fase mobile che viene con essa a contatto (liquida o gassosa). Le forze responsabilì di questo fenomeno sono principalmente: forze di London; forze di natura elettrostatica; legami idrogeno. La fase stazionaria (adsorbente) in genere è costituita da allumina, gel di silice, cellulosa, carbone attivo, ecc.; fase mobile: solventi acquosi e non acquosi, gas.

Cromatografia di ripartizione. - La fase fissa è liquida e viene trattenuta da un supporto inerte (cellulosa, ecc.) sul quale scorre la fase mobile che può essere liquida o gassosa (c. liquido-liquido, o c. gas-liquido). La sostanza da separare si distribuisce fra le due fasi e il processo è regolato dalla legge di Nernst.

Cromatografia a scambio ionico. - Sfrutta le proprietà che hanno alcune sostanze insolubili (scambiatori) di scambiare uno o più ioni presenti sulla propria superficie e legati a essa da forze elettrostatiche con uno o più ioni presenti nella soluzione in esame. Nel caso siano cationi, anioni o entrambi a essere scambiati si parla di scambiatori cationici, anionici o anfoteri. Esistono scambiatori a matrice organica e inorganica (polivinilici, polistirolici i primi, fosfato di zirconio, ecc., i secondi). A seconda del gruppo funzionale presente sulla superficie si hanno scambiatori forti o deboli (scambiatori forti: con gruppi solfonici o ammonici quaternari; scambiatori deboli: carbossilici, ecc.); altri scambiatori sono costituiti da cellulose modificate con l'introduzione di gruppi scambiatori forti o deboli. Su tutti questi supporti lo scambio viene regolato dalla legge di azione di massa.

Gel-filtrazione. - Si basa sul principio del setaccio molecolare: cioè le sostanze vengono separate a causa delle diverse dimensioni molecolari dato che alcune possono entrare nei pori del supporto e altre no; i setacci molecolari, con controllate dimensioni dei pori e adatti per questi scopi, sono generalmente costituiti da destrano legato trasversalmente, polivinil alcole o anche da piccole sfere di agar gel opportunamente disperse. Quando una miscela di molecole di dimensioni diverse è eluita cromatograficamente attraverso una colonna di gel, le molecole che sono troppo grandi per penetrare dentro i fori delle particelle del setaccio sono escluse (cioè eluite per prime) mentre le molecole più piccole sono diversamente ritardate a secondo della loro penetrazione nei fori del setaccio stesso. Questa tecnica è divenuta preziosa per la purificazione delle proteine e per la valutazione del peso molecolare di queste. Setacci molecolari capaci di essere usati in solventi organici sono stati impiegati nella separazione e nello studio di alti polimeri di sintesi.

In base alle tecniche adottate per la realizzazione del processo, i sistemi cromatografici vengono così suddivisi: a) c. su colonna, b) c. su carta; c) c. su strati sottili.

Cromatografia su colonna. - Il metodo su colonna, primo impiegato da M. Tswett, è stato migliorato usando un adsorbente finemente suddiviso e con grande uniformità e applicando una forte pressione alla colonna (c. in fase liquida sotto alta pressione). L'effluente viene fatto passare attraverso un detector (per es., spettrofotometro u.v., rifrattometro) che registra automaticamente i picchi delle sostanze eluite. La quantità delle sostanze separate può essere ottenuta, tramite misure manuali o attraverso strumenti, dall'altezza dei picchi o dalla superficie di questi. Si possono cosi ottenere in alcuni minuti (anche secondi) separazioni ottenibili in 6 - 8 ore con le vecchie tecniche.

Cromatografia su strati sottili. - Al posto della carta utilizzata nella tradizionale c. su carta vengono usati strati sottili di materiali diversi (gel di silice, cellulosa, allumina, poliammide, cellulose sostituite, ecc.) posti su vetro o supporti di plastica. Si hanno separazioni rapide in tempi brevi, poiché l'adsorbente è uniforme e permette di ottenere ottime separazioni. Inoltre si può effettuare una valutazione quantitativa delle sostanze raschiando la zona dove si trova localizzata la sostanza, estraendo questa con solventi opportuni ed effettuando un'analisi fotometrica; oppure effettuando prove direttamente sullo strato (per es. con spettrofotometria di riflettanza).

Si accenna infine ai più recenti progressi nel campo della gas-c. e a un particolare sistema cromatografico (affinity chromatography) in cui l'interazione enzimi-substrato viene impiegata come meccanismo di separazione.

Gas-cromatografia. - Le grandi possibilità che offre questa tecnica sono apparse evidenti dopo la prima analisi di un campione di benzina risolto in 60 picchi da A.J.P. Martin e A. T. James. Per la gas-c. si utilizzano o colonne impaccate con la fase stazionaria o tubi capillari nei quali la fase stazionaria (liquida o solida) può o ricoprire la superficie interna del capillare o riempire il capillare stesso. Lo sviluppo viene effettuato a temperatura costante o programmata. Per la rivelazione si usano detector altamente sensibili e capaci di essere usati in connessione con il sistema di registrazione impiegato. Uno degli abbinamenti analitici più validi è la combinazione gas-c.-spettrometria di massa. Si frazionano le miscele mediante gas-c. e si analizzano mediante spettrometria di massa.

Affinity chromatography. - Un supporto solido, specifico per un enzima, è preparato attaccando covalentemente un inibitore competitivo a un polimero legato trasversalmente o a un gel. Quando una miscela di proteine viene applicata su questo supporto, l'eluizione dell'enzima trattenuto dal suo inibitore sarà ritardata in rapporto alla sua costante di affinità con il supporto stesso, mentre le altre proteine, quelle senza affinità, emergono rapidamente. Il modo esatto di legare l'inibitore è molto importante sia per ottenere le separazioni sia per capire l'azione dell'enzima. L'affinity chromatography viene usata con successo per separare anticorpi specifici, enzimi, ormoni, inibitori, ecc.

Bibl.: Handbook of chromatography, Ohio 1972. Riviste: Chromatographia, Journal of chromatography, Journal of chromatographic science, Separation science.