reazione a catena della polimerasi
reazione a catena della polimerasi
Tecnica che permette di replicare, in vitro, frammenti di DNA con particolare efficienza e rapidità. Messa a punto nella prima metà degli anni Ottanta da Kary B. Mullis, motivo per cui ha ottenuto il premio Nobel per la chimica nel 1993, la PCR (Polymerase chain reaction) si caratterizza per una straordinaria semplicità concettuale tanto da far parlare di un vero e proprio ‘uovo di Colombo’. La PCR sfrutta alcune proprietà peculiari del DNA, come quella di separarsi nei due filamenti costituenti per effetto di un innalzamento della temperatura (denaturazione, fusione) e quella dei filamenti separati di associarsi per ricostituire la doppia elica allorché la temperatura viene riportata al valore di partenza. La miscela di reazione consiste, nel DNA da replicare, nei precursori della sintesi del DNA stesso (quattro diversi tipi di deossinucleosidi-trifosfato corrispondenti ciascuno a una base azotata: adenina, guanina, timina, citosina), in una variante termostabile dall’enzima DNA polimerasi e in due tipi di oligonucleotidi. Il processo di replicazione inizia con il riscaldamento della miscela a una temperatura tale da provocare la fusione della doppia elica e la sua separazione nei due filamenti costituenti (fase di denaturazione). La temperatura viene poi abbassata per dare modo agli oligonucleotidi di legarsi ai filamenti di DNA mediante legami deboli (fase di riassociazione); è attraverso questo passaggio che si crea una struttura molecolare su cui può agire la DNA polimerasi. L’enzima, utilizzando come substrato i deossinucleosidi-trifosfato, genera nuovi filamenti di sequenza corrispondente (complementare) a quella dei filamenti di partenza (fase di elongazione). A questo punto il processo viene fatto ripartire dall’inizio. A ogni ciclo le copie di DNA presenti nella miscela di reazione raddoppiano, per cui il processo assume un andamento esponenziale. Ne risulta la produzione di un numero elevatissimo di molecole di DNA in un tempo relativamente breve (alcune ore). Per questa proprietà la PCR trova innumerevoli applicazioni in campo tecnologico, in particolar modo nella cosiddetta diagnostica molecolare. Permette infatti di rivelare la presenza di un microrganismo patogeno (virus o batterio) attraverso l’amplificazione del suo DNA, con estrema sensibilità e attendibilità. Per motivi simili la PCR ha trovato importanti applicazioni anche in medicina legale.